Considerada el punto neurálgico del edificio constituye una obra maestra de la arquitectura española del Renacimiento español. Está construida en sillería de granito y su planta de cruz griega forma un cuadrado de 50 metros de lado.

Destacan los cenotafios reales de Carlos V y Felipe II a ambos lados del altar realizados por Pompeo Leoni en bronce dorado.